分子克隆——PCR（部分学校考流程），PCR技术是项生物实验室的标配技术，所以对于一些倾向于考查同学动手能力的研招单位来说，PCR技术流程是个重要知识点，下面我带同学们共同了解下。
一、主要流程
（1）获得并处理PCR引物；
（2）制备PCR mix;
（3）PCR仪操作；
（4）检测鉴定PCR产物。
二、溶液配方及原理
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
酶及其浓度：Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。Taq DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94000 Da。具有5’—>3的聚合酶活力，5’—>3’的外切核酸酶活力，无3’—>5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
此酶具有以下特点：
（1）耐高温，在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反应2小时后为原来的40%。
（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。
（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。
dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，多次冻融会使dNTP降解，-20℃贮存。理论上4 种 dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。在PCR反应中，dNTP应为50～200mol/l，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板（靶基因）核酸
PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102-105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物；导致PCR实验的失败。
模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1～10ng/ml，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。
Mg2+浓度：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。
三、操作步骤及细则
（1）在PCR仪上设置好程序。
（2）按如下体积（50u l体系）加样进行PCR反应：
编号 名称 浓度 体积
1 Taq 酶 5U/ul 1u l
2 ddH2O / 38u l
3 10 x PCR Buffer / 5u l
Mg2+ 25mM
4 dNTP mix 10mM 1u l
5 Primer 1 10mM 2u l
6 Primer 2 10mM 2u l
7 模板DNA样品 / 1u l
总体积 / 50u l
（3）混匀，短暂快速离心。
（4）放在PCR仪上进行PCR反应。按下列条件进行反应：

预变性 94℃ 5 min
变性 94℃ 0.5 min
退火 60℃ 0.5 min
延伸 72℃ 1.5 min
延伸 72℃ 10 min
4℃ ∞ min
（5）取5ml PCR反应液及1ml上样缓冲液混合，进行琼脂糖电泳(5V／cm)，选择适当大小的DNA分子量标准，检查扩增产物。
（6）紫外观察，并拍照记录电泳情况。