1.实验原理
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot,WB)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
2.细胞样品的预处理
从细胞间取出要收样的细胞,置冰上,用真空泵吸去培养基,加入预冷的PBS,洗一次。再往培养皿中加入1mLPBS,用干净的细胞刮将板中的细胞刮下,用移液枪转移至1.5mLEP管中,2300rpm 4℃离心5min。
直接在EP管中加入裂解液,冰上静置裂解10min后准备超声。EP管置于冰上,每管按如下程序超声:超声时间1~2s/次,间隔5~10s再重复下一次,总共10~20次。超声后离心,13000rpm 4℃ 15min。离心后将上清转入新的干净EP管中,置冰盒中。测定蛋白浓度一般可用考马斯亮蓝蛋白浓度测定法。使用酶标仪测定读数,波长选择595nm。可以测定两次读数,在数据处理时取平均值即可。
取适量上清(视上样量而定)转移到新的干净1.5ml EP管中,加入5×SDS loading buffer。100℃金属浴煮10min。煮沸后的样品可以及时上样跑胶,也可保存在-20℃,隔天或隔段时间跑胶。
3.主要流程
蛋白样品的提取制备
(细胞裂解液的配置、细胞或组织样品的处理、蛋白定量及上样前准备)
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电泳跑胶
(浓缩胶和分离胶的配制、对照的设置、蛋白上样、电泳参数设定)
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转膜
(转膜缓冲液的配置、裁胶、剪膜及其预处理、组装)
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封闭
(封闭液的配置、封闭时间)
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一二抗孵育
(一二抗的制备及使用注意事项、孵育后洗膜)
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曝光显影
(准备工作、AB液反应、胶片曝光显影)
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胶片的处理与保存
如果实验成功就可以看到非常漂亮的图
那么“双一流”院校考研怎么考WB呢?
最简单的题型是问答题,题目一般是这样的:请简要描述下Western lotting实验原理及其步骤?答案如上文所示,写清楚原理和流程即可。
还有一种题型:考查考生对实验图的分析能力,经常会给你一张WB图,让你说明蛋白之间的相互关联性,那么这种题就需要有文献阅读经历和实验经历,不然一般很少有人会分析。这种题型主要针对考厦大的同学。
不管实验题难易程度如何,建议大家原理一定要掌握,如果考查真的太难了,那么大家都不会,这个差距分不大,主要差距在很简单的题目,你不会,而你的竞争对手都会,这种题目才是能拉开差距的。