分子克隆—-连接

1.主要流程
设计方案确定连接体系，准备好所需试剂，加好样，适当温度下温育一定时间。

2.注意事项
(1）互补性粘性末端的连接
单一限制性内切酶或两种限制性内切酶（为同尾酶，如BamHI和BglII）分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：3-1：10 之间。
(2）平头末端的连接
是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇（PEG 8000）以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。
平端连接要求的条件：
① 低浓度（0.5mmol/L）的ATP。
② 不存在亚精胺一类的多胺。
③ 极高浓度的连接酶。
④ 高浓度的平端。
3.溶液配方及原理
（1）载体DNA和外源DNA
（2）DNA连接酶及缓冲液
DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+，ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。不同公司的连接酶缓冲液大部分含有Tris-HCl（pH 7.5）提供连接所需的合适pH值。另外在缓冲液中还有两种主要成份非常重要：DTT和ATP。前者提供一定的还原能力，而后者能促进连接反应的有效进行。
4.操作步骤
按照设计的连接体系：
（1）在无菌EP管中加入载体DNA和外源DNA；
（2）加入水、DNA连接酶缓冲液；（10xLigation Buffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。）
（3）加入DNA连接酶；（DNA Ligase对热敏感，容易失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。）
（4）适当温度下温育一定时间；
（5）如需在接反应后灭活DNA Ligase，可于65℃孵育10min即可。
5.结果分析
连接产物可电泳检测，理论大小应为DNA片段大小之和。
若结果不符，可能的原因及对策有：
（1）在DNA中存在连接酶抑制物（纯化DNA，用酚抽提并且乙醇沉淀）
（2）DNA连接酶失活 （更换新的DNA连接酶）
（3）反应缓冲液中ATP降解 （请于24个月内使用5×Rapid Ligation Buffer并于-20℃储存）
（4）限制性内切酶的存在导致连接产物被再次消化 （通过酚抽提并且乙醇沉淀去除限制性内切酶或者热失活内切酶）
（5）反应物中DNA被非特异性核酸内切酶降解 （尽量使用新的试剂，水要高压灭菌）