分子克隆-转化
遗传转化是指细菌品系由于吸收外源DNA转化因子而发生遗传性状的改变的现象,外源的DNA并在细菌品系稳定表达。DNA转化E.coli的技术路线包括制备感受态细胞和转化处理。
分子克隆全过程-PCR-酶切-连接-转化
转化主要实验流程:
1.混合感受态细胞与连接产物,冰浴,热激,摇床复苏,涂布
2.溶液配方
(1)LB固体(液体)培养基配制;
LB (Luria-Bertani)液体培养基
氯化钠(NaCl) 10 g
蛋白胨 (Tryptone) 10 g
酵母提取物 (Yeast extract) 5 g
溶于800 mL去离子水中,用NaOH调pH至7.0,加去离子水至总体积1 L,121℃高压蒸汽灭菌20 min。
LB固体培养基
在LB液体培养基中加入琼脂至终浓度为1.0%,121℃高压蒸汽灭菌20 min,待培养基温度降至50℃左右时加入抗生素至终浓度50 μg/mL,铺制平板,凝固后用封口膜封好,4℃保存备用。
(2)抗生素(Amp、 Kan)
原理:质粒载体通常含有某种抗性基因,使宿主能够在含有对应抗生素的培养基中生长,从而与其他不含有该抗性基因的细菌分离。
硫酸卡那霉素干粉用无菌去离子水配成浓度为50 mg/mL的溶液,-20℃保存备用。
氨苄青霉素干粉用无菌去离子水配成浓度为50 mg/mL的溶液,-20℃保存备用。
3.操作步骤
(1)在感受态细胞中加入5mL连接产物,轻轻混匀,冰水浴中放置30min;
(2)取出混匀后42℃水浴90sec;
(3)快速转移至冰水浴中放置1~5min,加入1mL LB培养基,37℃摇床复苏培养45min;
(4)室温6,000rpm离心5min;
(5)弃1mL上清,用剩余溶液重悬菌体沉淀,全部取出涂布于含抗生素的LB固体培养基上;
(6)生化培养箱中37℃倒置培养12~24h。
植物遗传转化是指通过某种途径将外源基因导入受体植物基因组中,并使之在受体植物细胞内实现功能表达。这个被导入的外源基因称为转基因,所得到的植株称为转基因植物。植物遗传转化是植物基因工程的主要内容。通过基因转移技术可以把不同来源的基因包括来自异种植物、动物和微生物的基因导入植物细胞,这种大范围的基因交流为创造有价值的植物新种质材料,并培育新品种奠定了基础。