分子克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法，通过酶切来构建载体是其中常用的一种方法，也是分子生物学考研中常考的知识点。今天我来给同学梳理一下。
一、主要流程
设计酶切方案，按照方案加好样，适当温度进行酶切反应，电泳分析
二、注意事项
在DNA的酶切反应中酶切条件是酶切成功的关键，主要影响因素有：
（1）反应温度 常规酶切反应均在37℃进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30℃，故最好根据所选用的酶确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切。
（2）反应时间 常规酶切反应时间为1.5小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长2～3小时，有时甚至可以过夜。
（3）加入酶量 在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。但实验中常常出现酶量加入过多酶切效果反差的现象，这主要是酶的储存液中含有50％的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10％时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10％，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star活性）。
（4）DNA纯度 在满足上述条件下影响酶切效果的主要因素是DNA的纯度，DNA样品中蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）的残留、高浓度的RNA等。另外DNA浓度过高也会导致酶切失败，当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大，将杂质相对浓度稀释，这样不需多增加酶量就能取得较好的酶切效果。
三、溶液配方
（1)常用的限制性内切酶
（2)酶切缓冲液，购酶时有附赠。
限制性内切酶其双DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+。厂商提供的限制性核酸内切酶有其相对应的缓冲液，一般的缓冲液种类为4-10种左右，按盐离子浓度可分为三大类：高盐、中盐和低盐。缓冲液配制为10×的母液，酶切时稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表选择缓冲液或采用万能缓冲液（Promega）。
（3)无菌双蒸水
（4)DNA样品
四、操作步骤
（1）纯化DNA样品；
（2）加无菌双蒸水于EP管中；
（3）加入酶切缓冲液；
（4）加入DNA样品；
（5）对应加入限制性内切酶；（限制性内切酶需置冰上）
（6）混合，低转速离心5秒；（混合液上无气泡）
（7）37℃或者16℃反应1.5-2小时。取出电泳分析或待用。
酶切体系举例：
ddH2O 6 μL
10×Buffer H 2 μL
DNA样品 10 μL
BamHⅠ 1μL
XhoⅠ 1μL
Total 20μL